在组织工程领域，缺氧是导致临床移植失败的主要原因之一，克服这一难题的潜在策略是制造用于原位组织再生的自发和连续供氧支架。受此启发，研究者设计了一种多功能含氟水凝胶，它不仅能及时、持续地为BMSC供氧，克服支架血管化前的缺氧，而且具有更高的抗菌能力，避免细菌感染。
研究者首先利用HAp依次与多巴胺（PDA）和全氟辛酰氯（PFOC）反应，得到HApPDA-F纳米粒子，然后与季铵化甲基丙烯酸化壳聚糖结合形成CS/HApPDA-F水凝胶。通过加入多巴胺修饰的氟化羟基磷灰石纳米颗粒（HApPDA-F）赋予水凝胶良好的生物降解性和生物相容性，而且还防止了移植过程中的细菌感染。接着，研究者利用SEM对水凝胶支架的形貌进行表征，水凝胶均表现出高度多孔且相互连接的结构，并且水凝胶的微观结构呈折叠状，表面凹凸不平（图1A）。无机纳米颗粒在水凝胶中的掺入大大改善了其力学性能（图1B），无机纳米颗粒与有机多糖链之间通过PDA基团形成的强配位力使水凝胶具有更好的抗外力和抗变形能力，表现出较高的压缩应力和应变。此外，无机纳米颗粒可以显著延缓水凝胶的生物降解（图1C）。为了检测HApPDA-F是否确实赋予水凝胶从高氧压力环境携带氧气并将氧气释放到低氧压力环境的能力，通过定制设备评估CS/HApPDA-F水凝胶的静态吸氧和释氧能力（图1D），结果显示CS/HApPDA-F具有良好的循环携氧能力和释放氧的能力，反复吸收和释放试验表明CS/HApPDA-F水凝胶可循环使用，无任何衰减（图1F，G），表明CS/HApPDA-F水凝胶由于加入了全氟碳化合物，水凝胶的携氧和持续释氧能力得到了增强。为了验证CS/HAp
PDA-F水凝胶能够为细胞建立氧合环境，研究者比较了水凝胶在常氧和缺氧条件下BMSC的形态。如图2A所示，在常氧条件下培养，所有水凝胶都与BMSC具有良好的亲和力，说明在正常培养条件下，氟化表面对细胞粘附的影响很小。细胞铺展面积定量分析和骨架染色显示：在常氧与缺氧条件下，细胞粘附在CS/HApPDA-F水凝胶上的面积均最大。低氧压力不利于细胞的扩张，导致细胞骨架明显萎缩。而CS/HApPDA-F水凝胶的持续供氧，使得细胞在缺氧条件下可以保持延伸形态。研究者探究在缺氧环境中，细胞在不同水凝胶中的增殖活力，结果显示：缺氧会抑制细胞的增殖活力，而CS/HAp
PDA-F水凝胶具有携氧和供养能力，能够提高缺氧状态下细胞的状态。细胞的增殖（Ki67）、凋亡（caspase3/7）以及缺氧诱导因子（HIF-1α）检测可以反映细胞在缺氧条件下的真实状态，免疫荧光检测和定量分析结果表明CS/HApPDA-F水凝胶携带和释放的氧能够改善缺氧状态下细胞的活力，使细胞增殖标志物Ki67上调，缺氧诱导因子HIF-1α、凋亡标志物caspase3/7下调。氧分压对BMSC的成骨分化有很大的影响，在缺氧条件下ALP的产生显著降低。但CS/HAp
PDA-F水凝胶具有携氧和释放氧的能力，改善了缺氧环境下的ALP活性（图4A，B）。钙沉积结果与ALP活性结果一致，HAp纳米颗粒促进基质矿化，CS/HApPDA-F水凝胶减弱缺氧环境的不利影响，促进BMSC在缺氧条件下的矿化。因此，CS/HApPDA-F水凝胶可使BMSC在缺氧条件下孵育5天后，仍具有足够的成骨分化潜能（图4A，C）。为了进一步评估低氧条件下BMSC在CS/HAp
PDA-F水凝胶上的成骨分化情况，研究者利用PCR检测成骨相关标志物ALP、Runx2、OPN和OSX的表达情况。结果表明，在常氧环境下，HAp的掺入可提高成骨细胞的基因表达水平，提示羟基磷灰石无机纳米颗粒可促进成骨细胞的分化。低氧环境下，对照组、CS/HApPDA组和CS/HApPDA组BMSC成骨相关基因表达均显著抑制。具有携氧功能的CS/HApPDA-F水凝胶能有效克服缺氧环境的限制，促进成骨相关基因的正常表达（图5）。骨植入物除具有良好的诱导成骨能力外，其抗菌能力是其成功的关键，可以避免术后细菌感染。抗菌实验显示：其他组水凝胶对细菌生长的抑制能力有限，而CS/HAp
PDA-F水凝胶能明显观察到有效的生长抑制现象，可能是全氟碳化合物在HAp纳米粒子表面的抗菌活性。采用细菌计数法检测其抑菌活性，与琼脂平板上结果一致（图6A，B）。细菌活/死染色进一步表明CS/HApPDA-F水凝胶中大部分细菌已被杀死（图6C）。最后，研究者使用颅骨缺损动物模型，将载BMSC水凝胶植入骨缺损。Micro-CT扫描显示有新骨形成，且以CS/HAp
PDA-F组的成骨效果最佳（图7A）。新生骨的定量形态学分析也表明CS/HApPDA-F的良好骨修复效果。HE染色结果表明，水凝胶植入颅骨缺损后，周围组织未见明显炎症，而且以CS/HApPDA-F组的骨修复效果较好，缺损区填充大量新生骨组织（图7C）。此外，在新的骨组织中可以看到新形成的血管（红色箭头）和成骨细胞（黑色箭头）。因此，这些结果证实了CS/HApPDA-F水凝胶能够在新生血管生长前为细胞生存和骨再生提供一个富氧微环境，对骨组织再生具有重要意义。本研究由来自华东理工大学的张伟安教授团队与上海交通大学的李瑾教授团队合作完成，并于年2月15日在线发表于AdvancedHealthcareMaterials。
论文信息：BaoxuanHuang,MingjiaoChen,JiaTian,YuanhaoZhang,ZhaoboDai,JinLi*,WeianZhang*.Oxygen-CarryingandAntibacterialFluorinatedNano-hydroxyapatiteIncorporatedHydrogelsforEnhancedBoneRegeneration.AdvHealthcMater,e.
供稿：刘大川
审校：刘昭
编辑：朱壮
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